765隐蔽、狡猾、善变
PD-L1 是肿瘤细胞、MDSCs、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。为了确定TB 小鼠MDSCs 的 PD-L1 表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了MDSCs 的 PD-L1 表达。结果表明，TME中MDSCs上PD-L1的平均荧光强度（MFI）从在 LLC 细胞接种后的第一周386.8± 100.9 a.u逐渐增加到第四周的1，068.0 ±121.8 a.u（ P <），这表明PD-L1 在我们模型中的MDSC 中具有潜在作用。
在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，MDSCs的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的MDSCs相同。此外，我们在TB小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的MDSCs在脾内聚集一致。
为了确定局部照射对肿瘤生长和MDSCs的影响，当肿瘤直径达到7.5 mm时，我们使用大分割治疗皮下LLC肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为500mm 3，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的CD11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是CD11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致MDSCs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总MDSCs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润MDSCs的比例比未治疗肿瘤高2倍(ctrlvs. RT=±% vs. ±%，P<)。PMN-MDSCs与总MDSCs具有相同的增加趋势(ctrlvs. RT=±% vs. ±%，P<)，而M-MDSC比例保持在约0.1%，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。
为了确定受照射肿瘤中PMN-MDSC 的逐渐积累是否有助于LLC 肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗Ly-6G 单克隆抗体来消耗MDSC .抗Ly-6G抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中PMN-MDSC的频率（P<）。此外，用抗 Ly-6G 抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明PMN-MDSC的募集对肿瘤再生至关重要。
虽然PMN-MDSCs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对CD8+T细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定RT 后 PMN-MDSCs 诱导的免疫抑制是否依赖于CD8 + T 细胞，我们通过流式细胞术评估了CD8 + T 细胞的数量和功能。
如图3D 所示，CD8 + T 细胞的百分比随着照射从± %下降到 ±%(P<)。PMN-MDSC耗竭逆转了这种下降（RTvs. RT + anti-Ly-6G 抗体= ±% vs. ±%，P<）。为了更好地了解CD8 + T 细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了CD8+ T 细胞内部和表面上IFN-y、CD28 和 PD-1 的表达。局部 RT 显着降低了 CD8 +T 细胞分泌 IFN-y的比例，从 %降至 %，并增加了表达 PD-1 的 CD8 + T 细胞的比例（ctrlvs. RT=± au vs. ±） au，P<）。
CD28 表达未观察到显着变化。当抗Ly-6G抗体被给予辐照小鼠时，IFN-y分泌达到与未处理的 LLC 小鼠相同的水平（±%），而与辐照小鼠进行比较抗Ly-6G抗体处理后的PD-1 表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议PMN-MDSCs 通过抑制CD8 + T 细胞促进放疗后肿瘤的再生。PMN-MDSCs 不仅抑制了TME 中 CD8 + T 细胞的数量，而且还抑制了其活性。
为了确定辐照诱导MDSCs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及iNOS和ARG1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部RT增强了ARG1的表达，但没有增强iNOS的表达。ARG1活性测定表明，局部照射显著提高了ARG1的活性，从 U/L提高到 U/L ((P<)。相比之下，NO荧光标记的iNOS活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。
PD-L1的表达是MDSCs 的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问PD-L1 上调是否是RT 后 MDSCs 介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后MDSC 中 PD-L1 的表达。图4E 显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的MDSC 中的PD-L1 表达在照射后不久显着增加（照射后第三天：ctrlvs. RT=443.9 ±175.3 au vs. 1328.0 ±324.3 au，P<）.然而，此后PD-L1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（ctrl vs. RT=1，465.0± 399.6 au vs. 407.5±164.8 au，P<）。外周血中MDSCs 的 PD-L1 表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。
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